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            MLR混合淋巴細胞實驗


            混合淋巴細胞培養(MLC)或稱混合淋巴細胞反應(MLR)常用于器官移植前的組織配型,以測定受體和供體主要組織相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴細胞接受同種異型抗原的刺激而發生活化、增殖,產生種類眾多的細胞因子,促進NK、LAK和CTL等殺傷細胞的分化,因此又是免疫調節研究中常用的實驗模型。


            一、實驗原理


            兩個無關個體功能正常的淋巴細胞在體外混合培養時,由于HLAⅡ類抗原中D和DP抗原(淋巴細胞鑒定的抗原,SD抗原)不同,可相互刺激對方的T細胞發生增殖,此為雙向混合淋巴細胞培養(two way MLC);若將其中一方的淋巴細胞先用絲裂霉素C(mytomycine C)處理或射線照射使之細胞中DNA失去復制能力,但仍能刺激另一方淋巴細胞發生轉化,稱為單向混合淋巴細胞培養(one way MLC)。兩個個體間HLA抗原差異程度越大,反應越強烈,可通過細胞數量、形態檢查或3H-TdR摻入率檢測反應細胞的增殖水平。如用經照射的、已知D位點抗原的純合子分型細胞(Homozygous typing cell,HTC)作為刺激細胞,則可檢測待檢者的D位點抗原型別。若待檢者抗原與標準HLA-D抗原相同,MLC不發生增殖,此為HLA-D抗原陰性分型法。EB病毒轉化的B淋巴母細胞表達高水平的HLAⅡ類抗原,常作為單向混合淋巴細胞培養中的刺激細胞。


            二、實驗方法


            這里介紹多年前做過的MLR的方法,絕對正宗,傳統的標準方法:


            1、方法


            分別取C57BL(H-2b)和Balb/C(H-2d)小鼠脾臟制備細胞懸液,Balb/C小鼠脾細胞懸液(2X107/ml)加絲裂霉素C(50微克/ml)處理,37oC,30min,培養液洗滌3次后用5%NBS培養液配制細胞懸液(5X106/ml),作為刺激細胞,加入96孔培養板,5X105/0.1ml/孔; 再加入C57BL脾細胞懸液,為反應細胞,也是5X105/0.1ml/孔;另設單獨刺激細胞孔和單獨反應細胞孔,均為三復孔。CO2孵葙培養5天,加3H-TdR 0.5 微居/孔,再培養12~16h后,收集細胞于玻璃纖維濾紙上,干燥后用液閃法測定cpm值, 根據以下公式計算刺激指數(SI):


            SI=(混合反應細胞孔cpm-刺激細胞孔cpm值)/ 反應細胞孔cpm值


            2、結果


            Balb/C小鼠6-8周齡脾細胞對C57BL小鼠脾細胞的MLR的SI為:13.5


            出生后0~2天去胸腺的Balb/C小鼠,6-8周齡的脾細胞的MLR的SI:3.0


            三、注意事項


            1、注意無菌操作。


            2、刺激細胞接受照射劑量要準確,使細胞暫時存活,但失去增殖的能力。


            3、可用Raji或Daudi細胞作為刺激細胞,也可將不同的細胞混合作為刺激細胞。


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